Определение подвижности бактерий. Производные микробной клетки
10. Подвижность бактерий, методы выявления подвижности.
Бактерии, образующие жгутики – подви жны. Поэтому о подвижности бактерий можно судить но наличию
жгутиков.
Методы выявления подвижности:
1. Окраска жгутиков по Леффлеру.
2. Исследование интактной культуры:
а) метод "раздавленная капля" - на середину предметного стекла наносят каплю суточной культуры бактерий и осторожно накрывают ее предметным стеклом так, чтобы жидкость не растеклась за его края и в нее не попадали пузырьки воздух.
б) метод "висячая капля" каплю бактерий наносят на середину покровного стекла, накладывают на него специальное предметное стекло с углублением, смазанным вокруг вазелином так, чтобы капля находилась в центре лунки, затем препарат осторожно переварачивают.
11. Принципы систематики микробов. Систематическое положение микробов. Таксономические категории. Понятие и критерии вида.
Систематика устанавливает положение живых существ в органическом мире, а также разрабатывает принципы, методы, правила классификации, номенклатуры и идентификации микроорганизмов.
1) Монофилитический принцип - все живое от одного предка.
2) Генетический принцип - установление связи между организмами на генетическом уровне и их иерархии, деление на группы, связи между собой.
Подходы систематики : геносистематика, хемосистематика, феносистематика и др.
Номенклатура установление соподчинённости и связи между МБ.
Органический мир делится на : надцарства, царства, типы, классы, порядки, семейства, роды, виды,
Все таксоны до вида определяются одним словом, вид - бинарное название(первое слово родовое
название, второе - видовое), подвид три елова(род, вид, название подвида).
Реально существует только вид - совокупность свободно скрещивающихся популяций, происходящих от
одного предка, обладающих общим генофондом, экологическим единством и репродуктивной изоляцией.
Критерии вида :
а) морфологический; б) территориальные свойства(способность окрашиваться); в) биохимический, г)
серологический (антигенная структура); д) биологический; е) экологический, ж) географический
Классификация микроорганизмов:
I. надцарство Прокариот
1 царство бактерий
1.1. тип Скотобактерии
1.1.1. класс Бактерии
1.1.1.1. порядок Истинные бактерии
1.1 1.2 порядок Спирохеты
1.1.1.3 порядок Акгиномицеты
1.1.2. класс Рикетти
1.1.2.1. порядок Рикетти
1.1.2.2. порядок Хламидии
1.1.3. класс Моликутес
1.1.3.1. порядок Микоплазмы
II.надцарсгво эуокариот
III. Царство Вирусов
1. царство Грибов
2.царство Простейшие.
По классификации Берджи царство Прокариот делится на четыре отдела:
1. Gracilicutes-тонкостенные, грамотрицательные
2. Firmicutes - толстостенные, граммположительные
3. Tenericutes лишены клеточной стенки(сюда включены микоплазмы)
4. Mendosicutes - архебактерии, стенки дефектные, лишены пептидогликана, особенности строения рибосом, мембраны и РНК.
12-16. Систематическое положение и морфология спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, хламидий. Методы изучения.
|
Спирохеты |
Актиномицеты |
Микоплазмы |
Риккетсии |
Хламндии |
|
|
Грампринад-лежность |
Не имеют клеточной стенки. Грам- | ||||
|
Мегоды диагностики |
окраска по Романовскому-Гимте, метод серебрения по Морозову, темнопольная или фазово-контрастная микроскопия |
Простые методы, окраска по Граму, Цилю-Нильсону |
Фазово-контрастная микроскопия Куртуральный и серотологические методы |
По методу Здродовского, по Граму, эл.микроскопия |
По Романовскому-Гимзе. |
|
Морфология |
Тонкие спирально извитые нити, изогнутые вокруг центральной оси, до 50 мкм |
Нитевидные витвистые клетки, имеющие вид палочки |
Мелкие или крупные сферические, овоидные или нитевидные клетки |
Мелкие полиморфные бактерии кокковидной, палочковидной или нитевидной формы |
Элементарные тельца сферической формы (вне человека) и ретикулярные тельца (внутриклеточные) |
|
Особенности структурной организации |
Her типичной КС, нет спор |
Не имеют жгутиков, капсул эндоспор |
Нет типичной КС, не образует спор и не имеет жгутиков |
КС построена по типу Грамм бактерии |
Безкапсульная |
|
Представители |
Патогенные и сапрофит; трепонемы(8-12 завитков), боррелии (3-8 завитков), лептоспиры(20-30 завитков) |
Большинство сапрофитов, патогенными являются роды Актиномицеты и Нокардии |
Патогенные и не патогенные формы, широко распространены в природе | ||
|
Вызываемые заболевания |
Сифилис, возвратный тиф, лептоспироз |
Нокардиоз, кожные мицетомы |
ОРЗ, атипичная пневмония и |
Риккетсиозы, сыпной тиф |
Трахома, орнитоз. паховый лимфогранулематоз |
6. Жгутики, ворсинки, пили. Способы передвижения прокариот. Методы определения подвижности у бактерий
Жгутики – тонкие, длинные, нитевидные, белковые образования. Из белка лабеллина. Он обладает сократительной способностью. По хар-ру расположен жгутиков и их кол-ву различ: монотрихи (один полярно расположенный жгутик), лофотрихи (пучёк жгутиков на одном конце), анфитрихи (по 1 или пучёк на противоположных концах кл), перитрихи (по всей поверхности), атрихи (неподвижные). Они хар-ны для молодых культур, с возрастом или при недостатке пит ср жгутики утрачиваются. Подвижность бактер определ микро и макроскопич методами. При микроскопич готовят мазки раздавленной или висячей капли. макроскопич – методом укола, посевом на полужиткий агар. Жгутики сост из 3 компонентов: базальное тельце, крючок, спиральная жгутиковая нить. Баз тельце сост из системы особых колец. У гр- бактер их 2 пары: внешняя L и Р и внутрен S и М. У гр+ S и М. в рез-те их вращения относительно друг друга происходит вращение жгутика. Крючок – изогнутый белковый цилиндр, выполняющий ф-цию гибкого связывающего звена между базальным тельцем и жёсткой нитью жгутика. Ьазальное тельце – сложная структура, состоящая из центрального стержня и колец. Передвижение прокариот осуществляется вращательными, поступательными, сгибательными движениями. Пили. У бактер, являющихся носителями плазмид имеются нитевидные структуры белковой природы. Построены из белка пиллина. Синтез этих ворсинок находится под контролем плазмидных генов. Пили явл аппаратом конъюгации с их помощью устанавливается контакт между кл донорам и кл реципиентом. Существует 2 класса пилей – половые и общего типа (фимбрии). Секс-пили – 1,2 и более 5 на 1 кл. Ворсинки (фимбрии). Короткие нити, кол-во кот может достигать много тыс. с их помощью бактерии прикрепляются к определённым поверхностям. Для многих болезнетворных бактерий фибрии явл фактором патогенности, т.к. с их помощью бактерии прикрепляются к чуствит кл и явл ф-ром адгизии. Вызывают агглютинацию эритроцитов.
7.Простые и сложные методы окрашивания микроорган
Практическое значение. Препараты окрашивают простым и сложным методами. Простой метод. Для окраски используют какой-либо один красящий р-р. На фиксированный мазок наносят р-р одного красителя: метиленовым синим окрашив 4 мин, генцианвиолетом – 2 мин, фуксином – 1 мин. Краску смывают водой, мазок высушивают фильтровальной бумагой. На готовый мазок наносят каплю иммерсионного масла, микроскопируют. Простая окраска позволяет быстро ознакомится с морфологией бактерий. Сложные методы. Применяют несколько р-ров красителе и реактивов. Они позволяют определить морфологию бактерий, их тинкториальные особенности и наличие структурных элементов кл, что имеет важное дифференциально-диагностическое значение. Одним из методов явл окрашивание по Грамму: на фиксированный препарат на 2 мин накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом. Бумажку снимают и наносят р-р Люголя на 2 мин. Сливают, мазок обрабатывают спиртом 30 сек, промывают водой и окрашивают фуксином 1 мин. По рез-ту окрашивания определ тип клеточной стенки. Методы окраски спор: метод Меллера: фиксированный мазок протравляют хромовой к-той 2 мин, промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, накладывают фильтровальн бумагу на мазок и наносят фуксин, препарат подогревают, окрашивают 7 мин, бумажку и краску сливают и обрабатывают серной к-той 5 сек, промывают водой, окрашив метиленовой синью 4 мин, промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют: споры розово-красные, вегетативная кл – синяя. Метод Златогорова – такой же, только не обрабатыв хромовой к-той. Метод Пешкова: мазок фиксируют, окрашивают метиленовой синью с подогревом, смывают водой, докрашивают р-ром нейтрального Красного 10 сек, смывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Споры синие, кл – красная.
8. Культивирование аэробных микроорган в условиях лаборатории. Методы выделения чистой культуры аэробных микроорган
Микроорганизмы, выращенные на искусственных пит ср – микробными культурами, а получение их роста на пит ср - культивированием. Для культивирования необходимы условия: оптимальный температурный режим с учетом, к какой группе относится исследуемый вид бактерий, соответствующие пит ср, аэробиоз (или анаэробиоз). Для обеспечения постоянной оптимальной температуры служат термостаты. Лабораторный термостат - шкаф с двойными стенками, снаружи облицованный материалом непроводником тепла (пластик), внутренняя стенка металлическая. Между двумя металлическими стенками находится вода (или воздух), подогреваемая электричеством. От нагретой воды через внутреннюю металлическую стенку тепло поступает в термостат. Внутри имеются сетчатые полочки, на которых размещают штативы с пробирками, чашки Петри и др. Постоянная температура поддерживается при помощи терморегуляторов - при достижении температуры заданного уровня автоматически происходит отключение прибора; при снижении температуры термостат вновь включается автоматически. Помимо обеспечения температурного режима, следует учитывать тип дыхания микроорганизмов: при аэробном типе дыхания никаких дополнительных условий создавать не нужно. Выделение из смеси одного вида микроба – выделение чистой культуры. Один из первых методов предложил Пастер – метод разведения. Исследуемый материал последовательно разводят в жидкой пит среде: берут ряд пробирок с МПБ, исследуемый материал вносят в первую пробирку, перемешивают, из неё переносят во вторую и т.д. Пастер предполагал, что в последней пробирке возможен рост одного вида микроба. Но это не так. Метод Коха – применяется плотная среда – используя принцип Пастера, исследуемый материал разводят в 4-5 пробирках с расплавленным и остужённым МПА, осторожно содержимое пробирки выливают в чашку Петри и распределяют среду тонким слоем, чашку закрывают, и когда А остынет переворачивают вверх дном. Ставят в термостат. Там где концентрация микробов меньше вырастают изолированные друг от друга колонии. С обратной стороны отмечают нужную колонию, делают посевы на МПБ и МПА и вырастает чистая культура. Метод Дригальского – метод пластинчатого посева. берут 4-5 чашек Петри. Агаровую среду расплавляют в колбе, разливают в чашки и ставят в термостат вверх дном. Шпателем Дригальского или пастеровской пипеткой равномерно растирают на поверхности среды каплю. Этим же шпателем растирают на поверхности второй чашки и т.д. Помещают в термостат вверх дном. Нужную культуру засевают в МПА и МПБ. Биологический метод – исследуемый материал вводят восприимчивому жив. При наличии патогенного микроба жив гибнут, их вскрывают и делают посевы. Метод Шукевича – подвижный микроб переходит на поверхность А из конденсационной жидкости, из верхнего края выросшей культуры делают посевы и получают чистую культуру. Химический метод – к пит ср добавляют хим в-ва, кот действуют на одних убийственно, у других задерживается рост, а третьи не восприимчивы.
9.Химический состав бактериальной Кл
75-85% вода, 25-15% - сухой остаток. Ведущая роль принадлежит 4 осн элемента, кот получил наз органогены: кислород – 30% сухого остатка, Н – 6-8%, С-45-55%, N-8-15%. Вода в кл может быть в 2 состояниях: свободная вода, кот явл растворит для кристалич в-в и в ней происходит движение ионов; связанная вода, кот входит в состав белков, жиров и углеводов. В бактериологич кл на долю белков – 60-70%, углеводы – 20%, липиды -1-2%. Повышенное содержан липидов придаёт клетке кислотно-спирто-щелочеустойчивость. Белки – высокомолекулярные полимерные соединения, образующиеся при гидролизе аминок-ты – сложные – протеиды, простые - протеины. Ф-ции белков – гл структурный материал для всех клеточн мембран, они обеспечив двигательн ф-ции, транспорт питат в-в через мембрану. Углеводы – многоатомные спирты (манит, дульцит) и полисахариды (гликоген). Играют энергитич роль в кл. Липиды – жирные к-ты и нейтральные жиры, фосфолипиды цитоплазматич мембраны. Явл резервом кл, использ как исходн компонент для синтеза белка. Мин в-ва – 3-10% сух остатка. Микро и макроэлементы. Микробные ф-ты. Гл св-ва: специфичность и термолябильность. У микроорганизм набор ф-тов генетически закреплён и передаётся по наследству. Различ ф-ты: 1. экзоф-ты – выдел кл во внешн среду и катализир разложен сложных в-в субстрата до более простых. 2. эндоф-ты – локализуются в самой кл и участвует во внутриклеточн процессах обмена в-в. 3. конститутивные – явл постоян компонентом кл и могут быть обнаружены даже при отсутствии в среде субстрата, кот они катализируют. 4. адаптивные – вырабатываются кл только тогда, когда в среде появл соотвествующий субстрат. Различают: оксиредуктазу, трансферазу, гидролазу, лиазу, изомеразу, лигазу и киназу. Наличие ф-тов можно обнаружить с помощью спец сред.
Два других отдела, отделенных мембраной, пирреллюлозому или рибоплазму, которая содержит рибосомы и связанные белки, и свободный от рибосом парафоплазму (Glockner, 2003). 3. Характеристика общих свойств микроорганизмов Микроорганизмы - это организмы, невидимые невооруженным глазом из-за их незначительных размеров. Этот критерий - единственный, который их объединяет. В остальном мир...
По числу совпадающих признаков. Указанный подход к систематике микроорганизмов достаточно объективен, однако для его реализации необходимы обширные математические расчеты с использованием электронно-вычислительных машин. После подробного изучения микроорганизму дают научное название, которое должно быть выражено двумя латинскими словами, как этого требует биноминальная номенклатура, предложенная...
В автотрофных условиях. Соответственно окисляемым субстратам выделяют такие группы хемолитоавтотрофов, как водородные, нитрифицирующие, серные бактерии, железобактерии. К числу хемолитоавтотрофных микроорганизмов, окисляющих Н2, относятся также многие метанобразующие бактерии, отдельные представители ацетатобразующих, сульфат- и серувосстанавливающих бактерий. Различные возможности проявляют...
Высказывается также предположение, что мезосомы не принимают активного участия в процессах клеточного метаболизма, но выполняют структурную функцию, обеспечивая компартментализацию прокариотной клетки, т. е. пространственное разграничение внутриклеточного содержимого на относительно обособленные отсеки, что создает более благоприятные условия для протекания определенных последовательностей...
Прочитайте:
|
Для определения подвижности бактерий применяют методы «висячая капля» и «раздавленная капля».
Метод «висячая капля». Каплю 18...20-часовой бульонной культуры или каплю конденсата агаровой культуры наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой), края которого слегка смазывают вазелином, накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло прилипло к предметному стеклу. Препарат перевертывают покровным стеклом вверх, и капля «висит» над луночкой (рис. 14).
Микроскопируют препарат в сухой системе объективов при слегка затемненном поле зрения (пользуются диафрагмой и опущенным конденсором). Под малым увеличением находят край капли, затем, приподняв тубус, переводят в рабочее состояние объектив среднего увеличения (40...60), осторожно,
под контролем глаза (смотреть сбоку) опускают тубус до соприкосновения фронтальной линзы объектива с покровным
стеклом. Затем, глядя в окуляр, осторожно поднимают
макрометрическим винтом тубус и находят в поле зрения
каплю. Далее микрометрическим винтом настраивают микроскоп до оптимальной видимости микробов. Рис. 14. Препарат «висячая капля.
Метод «раздавленная капля». На обычное предметное стекло наносят каплю суточной бактериальной культуры, осторожно накрывают покровным стеклом так, чтобы между стеклами не образовались пузырьки воздуха, а капля культуры не растеклась за края покровного стекла. Осторожно опускают объектив среднего увеличения и микроскопируют.
В обоих случаях на сероватом фоне поля зрения хорошо заметно движение микробных клеток.
Приготовление красителей и окраска мазков-препаратов. Методы пересева микроорганизмов.
Микроскопируют микробы в живом и неживом состоянии. Для изучения морфологических и тинкториаль-ных свойств микроорганизмов готовят специально окрашенный препарат, применяя для этого различные анилиновые красители.
Краски и красящие растворы. Наиболее часто в микробиологической практике используются следующие анилиновые краски: фуксин (основной), метиловый красный, нейтральный красный - в растворе имеют красный цвет; карболовый кристаллвиолет, ме-тилвиолет, генцианвиолет, готовая жидкая краска Гимза (азур-эозин) фиолетового цвета; метиленовая синь, бриллиантовая и малахитовая зелень.
Из сухих кристаллических или порошкообразных красителей готовят водные или спиртовые растворы красок. Последние обычно готовят впрок, так как они хорошо сохраняются в темноте (посуда из темного стекла, темное помещение). Для усиления действия красящих растворов на микробную клетку используют различные протравители, которые добавляют в раствор красителя (фенол, едкий калий) или ими обрабатывают препарат перед окрашиванием (слабые растворы соляной, серной или хромовой кислот). Также с целью протравливания препарат с налитой на него краской прогревают или заливают предварительно подогретым раствором краски. Краски, нестойкие в растворе, не сохраняющиеся длительное время, готовят только непосредственно перед употреблением в виде 1 ...2%-го раствора.
Спиртоводные растворы. Карболовый фуксин (фуксин Циля). Кристаллы основного фуксина предварительно растворяют в 96%-м этиловом спирте. Сначала готовят насыщенный спиртовой раствор (на 5...10 г краски 100 мл спирта). Для лучшего и более быстрого растворения кристаллы краски предварительно растирают в фарфоровой ступке в небольшом количестве спирта с добавлением нескольких капель глицерина. Чисто спиртовой раствор для окраски непригоден, поэтому готовят спиртоводный раствор: к 10...20 мл насыщенного спиртового раствора фуксина добавляют 100 мл дистиллированной воды с 5 % фенола (протрава). Полученный раствор фуксина фильтруют через фильтровальную бумагу. В ряде случаев фуксин Циля перед использованием разбавляют еще раз дистиллированной водой (1:10) и получают его рабочий раствор (фуксин Пфейффера).
Карболовый кристаллвиолет, метипвиолет, генцианвиолет. Первые два красителя в растворе очень быстро выпадают в осадок и при окрашивании могут исказить микроскопическую картину. Чаще используют генцианвиолет, который получают смешением метил- и кристаллвиолета с добавлением декстрина; он дает более ровное окрашивание. Для приготовления спиртоводного раствора 1 г сухого генцианвиолета растворяют в 10 мл спирта, растирая в ступке с глицерином и кристалликами фенола (2 %), затем добавляют дистиллированную воду. Чтобы избежать образования осадка при хранении раствора, листы фильтровальной бумаги пропитывают насыщенным спиртовым раствором краски, высушивают их на воздухе, нарезают мелкими полосками или квадратиками и сохраняют в темной банке с притертой пробкой.
При окраске препарата на него накладывают высушенную полоску с генцианвиолетом, сверху наливают несколько капель воды, выдерживая 2...3 мин.
Раствор метиленовой сини (щелочная синь Леффлера). Для приготовления раствора 3 г краски настаивают длительное время (3...4 мес) в 100 мл 96%-го спирта, затем 30 мл насыщенного раствора разбавляют в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 1 мл!%-го раствора едкого калия (протрава). Фильтруют.
Водные растворы. 2%-й сафранин: 2 г сухого красителя заливают 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр и сразу используют свежий раствор для окрашивания.
1%-й раствор малахитовой зелени: 1 г кристаллической краски растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют ее, остужают и используют для окрашивания.
Готовую жидкую краску азур-эозин (краска Гимза) применяют при специальных методах окрашивания бактерийных препаратов. Перед употреблением ее необходимо разбавить дистиллированной водой (1:10), но при этом сразу образуется осадок. Чтобы последний не влиял на препарат, окрашивание проводят, по рекомендации Романовского, следующим образом: на дно чашки Петри кладут стеклянные палочки или спички с обломанными головками, на них помещают препарат мазком вниз, раствор краски подливают под препарат (метод Романовского-Гимза).
Для эффективного воздействия на бактериальный состав среды необходимо иметь достоверную информацию о его качественном и количественном содержании. Существует много методов определения бактерий, и выбор способа изучения образца зависит от того, какие результаты должны быть получены. Метод определения молочнокислых бактерий отличается от методики выявления Listeria monocytogenes, а определение ферментативной активности производится иначе, чем определение биохимических свойств.
Методы определения по получаемому результату можно разделить на две большие группы:
- определение количества микробов;
- качественное исследование.
Результаты анализа бактериального состава образцов выражают общим микробным числом, выраженным в КОЕ (колониеобразующие единицы).
Анализ количества микробов, в зависимости от его возможностей, может определять:
- число всех микроорганизмов, содержащихся в образце;
- только жизнеспособные микробы.
В зависимости от способа получения результата, методы определения количества микроорганизмов подразделяют на:
- прямые (микроскопические);
- косвенные.
В свою очередь, косвенные методы разделяют в зависимости от применяемого критерия как:
- методы оптического исследования (спектрофотометрия, нефелометрия) – измеряемый параметр зависит от количества микроорганизмов;
- высев – метод измерения образовавшихся колоний.
Методы определения общего количества бактерий опираются на значение титра образца.
Методика титра
Метод предельного разбавления образца (метод титра) позволяет с высокой точностью определить количественное значение группы микроорганизмов.
Сущность методики заключается в том, что исследуемая проба разводится определенным образом и высевается в специфические для микроорганизмов среды. Так создаются благоприятные условия для роста. По прошествии времени исследуют образцы, устанавливая, при каком предельном разведении выявляются бактерии определенной группы. Выводы делаются по специфическим изменениям питательного субстрата.
Подобная методика, учитывающая индивидуальные свойства микробов, хорошо зарекомендовала себя при обнаружении микроорганизмов кишечной палочки и родственных ей видов.
Прямой подсчет
Метод удобен для исследования проб почвы и воды. Осуществляется прямой подсчет в предназначенных для этого счетных камерах, на мембранных фильтрах или фиксированных мазках. Метод не требует сложного оборудования, непродолжителен по времени и минимален по стоимости.
Ограничением использования метода является обязательная высокая концентрация микробов в образцах.
Метод оптического определения количества бактерий, основанный на определении светорассеивания взвесью образца. Данный способ позволяет определить число клеток в образце, что делает метод востребованным при микробиологических исследованиях.
Метод нефелометрии
Подсчет жизнеспособных микробов
Методика базируется на посеве определенного количества бактерий в виде суспензии на среду агара. После этого осуществляют подсчет сформированных колоний, имея в виду, что каждая из них является потомством жизнеспособной бактерии.
Существует две разновидности способа посева образца:
- исследуемый образец вносится в среду агара и перемешивается;
- образец высевается на поверхностном слое агара.
Подвижность как важный фактор идентификации бактерий
Значимым фактором идентификации бактерий является подвижность, которая обеспечивается жгутиками. Так как количество и расположение жгутиков, обеспечивающих подвижность, может быть различным, все имеющие жгутики микробы подразделяют для удобства идентификации на:
- монотрихи – один жгутик на полюсе;
- лофотрихи – пучок жгутиков, расположенный на одном из полюсов;
- амфитрихи – жгутики или пучки расположены на обоих полюсах;
- перитихи – жгутики расположены по периметру клетки.
Определение подвижности бактерий проводят в культурах не старше суток. У старых культур способность передвигаться утрачивается.
Определение качественного бактериального состава
Определение качественного состава бактерий опирается на несколько факторов.
Биолого-химические особенности микроорганизмов
Изучение биохимических свойств микроорганизмов помогает определению качественного состава бактерий.
Идентификации микроорганизмов способствует знание биохимических процессов. Методы определения количества и качества бактерий опираются на протеолитические и сахаролитические свойства микроорганизмов, а также токсино- и пигментообразование.
Ферменты микробов
Одним из факторов жизнедеятельности бактерий является ферментативная активность: ферментный состав и свойства регламентируются геномом микроорганизма и является стабильным критерием идентификации микробов. Поэтому обнаружение протеолитических, сахаролитических и других ферментов имеет большое значение в идентификации микроорганизмов.
К примеру, критерием протеолитической активности микроорганизмов является способность бактерий расщеплять белок до продуктов глубокого распада (сероводород и индол). На этом результате ферментативной активности основан метод определения числа микроорганизмов, имеющий важное практическое значение.
Свойство пигментообразования
Другим стойким генетическим признаком бактерий является пигментообразование. Данное свойство предназначено для защиты бактериальной клетки от воздействия ультрафиолетовых лучей.
Большая часть патогенных микроорганизмов не обладает подобными защитными свойствами – пигментообразование для них не характерно.
Изучение микрофлоры молока
Определение бактерий имеет значение в практической деятельности человека, например, в пищевой промышленности. Так, бактериальная обсемененность молока является основным показателем санитарных условий его получения. В случае превышения порогового количества микроорганизмов в молоке, сортность продукта снижается.
С 1987 г. страны ЕЭС приняли единые стандарты по степени бактериальной обсемененности молока, подразделяя продукт на три категории:
- А – 20 тыс./мл;
- В – 100 тыс./мл;
- С – свыше 100 тыс./мл.
В данном случае числа указывают на максимально возможное количество микроорганизмов в 1 мл молока (обсемененность).
Бактериальная обсемененность молока напрямую зависит от санитарных условий получения и первоначальной обработки продукта. Так, использование для очистки молока многоразовых фильтров может приводить к дополнительному бактериальному обсеменению.
Наличие в молоке соматических клеток является важным критерием качества. Эти клетки являются частичками биомассы животного. Они образуются в вымени и отражают естественные процессы старения и обновления организма.
Число соматических клеток в молоке возрастает при наличии у животных травм, заболеваний ЖКТ или других патологий, что приводит к росту показателя бактериальной обсемененности молока.
Определение молочнокислых бактерий
Большое значение в пищевой промышленности уделяется молочнокислым микроорганизмам благодаря их антагонистической и протеолитеческой активности.
К примеру, пластичная консистенция и выраженный вкус различных сортов сыра связаны с протеолитической активностью молочнокислых микробов закваски. Исследованиям активностью молочнокислых бактерий в этой области уделяется большое значение, но, до сих пор не удалось создать критерий определения штаммов молочнокислых бактерий закваски по показателю протеолитеческой активности.
Антагонистическая активность молочнокислых микробов используется не только в пищевой промышленности, но и в медицине, ветеринарии сельском хозяйстве и т.д.
Примеры применения молочнокислых бактерий как антагонистов к определенным микроорганизмам:
- производство сыров – антагонисты к масляным микробам и кишечной палочке;
- хлебопекарное производство – антагонисты к споровой палочке, возбудителю «картофельной болезни» хлеба;
- молочнокислые продукты – антагонисты к бактериям, провоцирующим развитие желудочно-кишечных инфекций.
При необходимости подсчета в закваске количества молочнокислых бактерий используют метод посева микробов на агаре и молоке с добавлением мела. Образующаяся молочная кислота растворяет мел, и вокруг колоний молочнокислых бактерий появляются светлые зоны.
Для подсчета молочнокислых стрептококков используют метод предельного разведения, высевая их в молоко. В зависимости от термофильности молочнокислых бактерий выбирается оптимальный термальный режим посева. Образцы со свернувшимся молоком используют для приготовления микроскопических препаратов. После этого выявляют минимальное разведение, содержащее молочнокислые палочки.
Воздушный микробиологический контроль
Для жизнедеятельности бактерий воздушная среда не является благоприятной, но большинство микроорганизмов, попадая в воздух, способны временно сохранять активность и свои свойства. Среди них такие патогенные бактерии, как возбудители кори, скарлатины, коклюша, оспы, туберкулеза, легочной чумы и другие инфекции дыхательных путей, передающиеся воздушно-капельным методом.
Микробиологический контроль воздушной среды оценивает общую бактериальную обсемененность воздуха и разрабатывает профилактические методы снижения числа возбудителей инфекционных заболеваний.
Объектами исследования степени бактериальной обсемененности в закрытых помещениях являются больницы и поликлиники, детские учреждения и места постоянного скопления людей (кинотеатры, спортзалы и другие). Определение степени бактериальной обсемененности воздуха в помещениях проводится по отработанным методикам, включающим следующие действия:
- забор образца;
- транспортировка и подготовка пробы;
- бактериальный посев;
- определение микроорганизмов посредством идентификации.
В случае выявления высокой степени бактериальной обсемененности, для понижения количества бактерий используют различные методы:
- химические – обработка помещения двуокисью азота, озоном или суспензией молочной кислоты;
- механические – принудительная фильтрация воздуха;
- физические – облучение ультрафиолетом.
Исследование бактериального состава воды
Анализ воды проводят на наличие следующих групп микроорганизмов:
- колиформные микробы – микроорганизмы группы кишечной палочки, используются как маркеры фекальной контаминации (обсеменения);
- клостридии – микробы, обладающие высокой устойчивостью к обеззараживаннию; реперный показатель (ориентир) – если в пробе нет клостридий, то нет и других патогенных микробов;
- вирусы;
- лямблии.
Колиформные бактерии являются грамотрицательными бактериями группы кишечной палочки, обитающими в кишечнике млекопитающих и птиц. В воду они попадают с фекалиями, способны существовать в ней неделями, но теряют свойство размножения.
Наличие колиформных микроорганизмов в образце воды указывает на высокую вероятность присутствия сточных вод. Наличие вирулентных (болезнетворных) штаммов колиформных бактерий – показатель риска возникновения заболеваний.
Колиформные микробы включают в себя группу термотолерантных колиформных микроорганизмов, обладающих свойством выживать при высоких (45°С) температурах. Термотолерантные колиформные бактерии являются индикатором недавнего фекального заражения, аналитически легко определяются.
Согласно СанПиН, колиформные бактерии не могут присутствовать в системах водоснабжения, а наличие колиформных микроорганизмов указывает либо на некачественную очистку, либо на вторичное фекальное загрязнение. Нормой считается наличие колиформных микробов в количестве не более 5% от общего числа. Критерием эффективности очистки от фекальных стоков являются термотолерантные колиформные бактерии, как легко определяемые.
Выявление возбудителя листериоза
Бактерия Listeria monocytogenes является возбудителем листериоза – инфекционного заболевания людей и животных.
Listeria monocytogenes
Возбудитель листериоза – имеющая высокую подвижность неспорообразующая грамположительная кишечная палочка Listeria monocytogenes. У людей заражение Listeria monocytogenes протекает как острый сепсис, поражая центральную нервную систему, лимфосистему, миндалины, селезенку и печень. Поражение Listeria monocytogenes у человека может протекать как в острой, так и в хронической форме.
Статистическая группа риска по Listeria monocytogenes:
- люди преклонного возраста;
- беременные;
- лица с ослабленным иммунитетом, ВИЧ-инфицированные и онкобольные;
- алкоголики и наркоманы.
Определяется зараженность Listeria monocytogenes методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) – в плазме крови выявляется ДНК Listeria monocytogenes. Подтверждением наличия листериоза является выявление специфичного участка ДНК Listeria monocytogenes. Специфичность определения ДНК Listeria monocytogenes – 100%; метод является высокочувствительным.
Взаимодействие бактерий с антибиотиками
Выявление чувствительности бактерий к антибиотикам имеет большое практическое значение для расчета дозировки препаратов при профилактике и лечении инфекционных заболеваний.
Для выявления чувствительности микробов к различным антибиотикам применяются два основных метода:
- определение чувствительности к антибиотиками при помощи дисков;
- изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам посредством серийного разведения.
Методика с использованием дисков
Для выявления степени чувствительности к антибиотикам, в питательную культуру засевают изучаемые бактерии. На поверхности размещают диски, содержащие различные антибиотики в известных дозировках.
Пробу выдерживают при оптимальной температуре (37°С) сутки, после чего, сравнивая диаметр кольцевых безмикробных зон вокруг различных дисков, делают вывод о чувствительности бактерий к различным антибиотикам и их концентрациям.
Для получения воспроизводимых результатов следует пользоваться стандартными дисками и питательной средой, а в качестве контроля применять эталонные штаммы. Методика дисков не позволяет получить надежные результаты, а так же очень критична к слабодифундирующим антибиотикам (ристомицин или полимиксин).
Серийное разведение
Чувствительность микробов к антибиотикам методом серийного разведения позволяет выявить минимальную концентрацию лекарственного препарата, оказывающую терапевтический эффект. Чувствительность микроорганизмов определяют, как:
- чувствительные штаммы – жизнедеятельность бактерий подавляется обычной дозировкой антибиотиков в крови;
- умеренно устойчивые штаммы – для ингибирования бактерий необходимо использование максимальных доз антибиотиков;
- устойчивые бактерии – жизнедеятельность бактерий не подавляется даже при максимальной концентрации антибиотика, то есть отсутствие чувствительности.
Определение чувствительности бактериофагов
Бактериофаги являются естественными врагами бактерий. Характер взаимодействия бактериофага с бактериями описывается как:
- вирулентное, вызывающее лизис (гибель) микробной клетки;
- умеренное – переход бактерии в неинфекционную форму фага (профаг).
Бактериофаги специфичны к определенным группам микроорганизмов, что отражается в их названии – стрептококковые фаги, стафилококковые фаги и т.д. Способом определения количества бактериофагов в единице объема является метод агаровых слоев. Он прост в исполнении и обладает достаточной точностью.
Таким образом, существует большое количество методов определения микроорганизмов. Выбор оптимального зависит от заданного критерия отбора.
Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.
Цель занятия . Усвоить методы окраски спорообразующих, капсулообразующих бактерий, а также определение подвижности бактерий.
Материалы и оборудование . Взвеси бактерий с вакцинным штаммом сибирской язвы, клостридиями, готовые препараты с капсулообразующими бактериями, подвижные бульонные культуры эшерихий 18 часового роста, предметные и покровные стекла, плакаты, 2% раствор сафранина, водный раствор малахитовой зелени, карболовый фуксин Циля.
Методические указания . Каждый студент готовит мазки из взвесей микроорганизмов и окрашивает их по методу Трухильо, Ольта, микроскопирует и зарисовывает; готовит препарат для изучения подвижности микроорганизмов методом «раздавленная» и «висячая» капля.
Окраска спор . При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к роду Bacillus и называются бациллами. Микроорганизмы рода Clostridium имеют споры диаметр которых превышает ширину микробной клетки и называются клостридиями. По форме они бывают овальные и круглые (рис. 5).
Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей.
Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает дополнительный краситель.
Техника окраски спор методом Трухильо . На фиксированный мазок накладывают небольшой кусочек фильтровальной бумаги и на нее наносят водный раствор малахитовой зелени.
Рис. 5. Споры микроорганизмов различных типов
Подогревают препарат на пламени горелки до появления паров и выдерживают в течение 3 минут, промывают водой и докрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина 1 минуту. Промывают водой и высушивают. Микрокартина: споры зеленые, а вегетативные клетки красные.
Окраска капсул . Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой. Капсула - муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) (рис. 6). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:
а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется;
б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой;
в) промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Техника окраска капсул по методу Ольта . Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в краснокирпичный цвет, капсула в - желто-оранжевый.Определение подвижности бактерий.
Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков - специальных тонких нитевидных образований.
Рис.6.Капсула у бактерий
а ‑ бацилла сибирской язвы; б - диплококк
Жгутики бывают различной длины.
Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют (рис. 7):
а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас);
Рис. 7. Типы расположения жгутиков у бактерий
б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);
в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;
г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E.coli).
Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.
Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.
Определение подвижности бактерий методом «висячая капля». Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой (рис. 8). Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые.Методом Шукевича. Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).
Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».
Метод посева уколом в полужидкий агар. Для этого бактериологическойпетлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.
ЗАНЯТИЕ 5. Лабораторная посуда и её подготовка. Питательные среды. Методы приготовления и стерилизации питательных сред. Методы стерилизации лабораторной посуды.
Цель занятия. Подготовить посуду. Приготовить питательные среды. Определить рН сред. Ознакомиться с методами стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.
Оборудование и материалы. Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки, чашки Петри, бумага. Автоклав, сушильный шкаф. Набор сред и химических реактивов. рН -метр.